一、 貼(tie)壁細胞傳(chuan)代(dai)（以一個(ge)T25瓶為例）
1、 吸(xi)出原培養(yang)液；
2、 加入2ml左右(you)PBS，輕輕晃動培養瓶潤洗細胞(bao)，吸出(chu)PBS丟棄(qi)；
3、 加入(ru)1ml左右胰酶，輕輕晃動培養瓶使之浸潤所有細胞，放入(ru)培養箱消化；
4、 消(xiao)化(hua)時間跟(gen)據細(xi)胞特(te)性有(you)所不同，顯微鏡下看到細(xi)胞塊中間的細(xi)胞明顯分離變圓，側(ce)立培養瓶(ping)細(xi)胞可以滑落(luo)時可終止消(xiao)化(hua)，全程不要拍打培養瓶(ping)；
5、 加入3ml含血清的培養基終(zhong)止消化，吹打(da)(da)細(xi)胞使之脫落并在(zai)液(ye)體里反復吹打(da)(da)使細(xi)胞，使之盡量呈單顆細(xi)胞的懸浮液(ye)，這時可(ke)以在(zai)顯微鏡看下(xia)；
6、 收集細(xi)胞懸液離(li)心，1200rpm（約250g） 3分鐘(zhong)，離(li)心完吸出上清丟棄。
7、 加(jia)入(ru)新鮮培(pei)(pei)養(yang)基，吹打幾下混勻細胞(bao)即可，按(an)需接種到新培(pei)(pei)養(yang)瓶(ping)，補足培(pei)(pei)養(yang)基，擰松瓶(ping)蓋或使(shi)用透(tou)氣(qi)瓶(ping)蓋進行(xing)培(pei)(pei)養(yang)。
8、 檢查培養(yang)箱二氧化碳，溫度和水盤。
二、 懸浮細胞傳代（以一個T25瓶為例）
1、 輕(qing)輕(qing)吹(chui)散(san)懸浮(fu)細(xi)胞，部分(fen)貼壁松散(san)的懸浮(fu)細(xi)胞可直接吹(chui)打培(pei)養瓶底部使細(xi)胞懸浮(fu)，收集細(xi)胞懸液到(dao)無菌離心(xin)管中(zhong)，離心(xin)1200rpm（約250g） 3分(fen)鐘(zhong)，離心(xin)完(wan)畢吸(xi)出(chu)上清丟棄;
2、 加(jia)入適(shi)量新鮮培(pei)養基(ji)重懸細胞(bao)，按(an)(an)比例接種至培(pei)養瓶（接種比例按(an)(an)實際情況，不確(que)定可計(ji)數后再接種）;
3、 常規細胞推薦以3~5×105cells/ml傳代，長到2×106cells/ml傳出;
4、 建議剛開始幾代(dai)計(ji)數(shu)后(hou)(hou)傳代(dai)，后(hou)(hou)面可(ke)以根據經驗按(an)比例(li)傳代(dai)。
三(san)、 半貼(tie)壁(bi)半懸(xuan)浮細胞傳代（以一(yi)個T25瓶為例(li)）
1、 培養液（含懸浮的細(xi)胞）：用移液器(qi)吸出培養液轉移到(dao)無菌離(li)心管(guan)中；
2、 貼壁部分：用(yong)1ml PBS洗細胞(bao)，吸出PBS放入到第1步裝有(you)培養液的離心管中(zhong)收集（不要直接丟棄，里面有(you)細胞(bao)）；
3、 培養瓶加入胰酶1ml，放入培養箱靜置(zhi)消化；
4、 消化時間跟據細胞(bao)特(te)性(xing)有(you)所不(bu)同，顯微鏡下看到(dao)細胞(bao)明顯收縮(suo)變圓，側立培(pei)(pei)養瓶細胞(bao)可以(yi)滑落時可終(zhong)止消化，全程(cheng)不(bu)要拍打培(pei)(pei)養瓶；
5、 用3ml含(han)血清的(de)培養基終止消化，將消化下來的(de)細(xi)胞(bao)懸液吹散細(xi)胞(bao)后收(shou)集到第(di)1步的(de)離(li)心管；
6、 將離(li)心管在1200rpm（約(yue)250g） 3min離(li)心，離(li)心完畢(bi)棄(qi)掉上清(qing)，加(jia)入新的培(pei)養基重(zhong)懸，按(an)實際情況分瓶(ping)，放入培(pei)養箱培(pei)養。
溫馨(xin)提(ti)示：
1、 每丟(diu)棄一個液體前都要(yao)想一下里面有(you)沒有(you)可能有(you)細胞，避免丟(diu)失細胞。
2、 細(xi)胞(bao)(bao)(bao)種類、細(xi)胞(bao)(bao)(bao)密度、細(xi)胞(bao)(bao)(bao)狀態、甚(shen)至胰酶的(de)品牌，均影響到細(xi)胞(bao)(bao)(bao)的(de)消(xiao)(xiao)(xiao)化(hua)時間，所以消(xiao)(xiao)(xiao)化(hua)的(de)時候不要(yao)只看時間，以顯(xian)微鏡下細(xi)胞(bao)(bao)(bao)的(de)狀態來確定消(xiao)(xiao)(xiao)化(hua)終點，部分難消(xiao)(xiao)(xiao)化(hua)的(de)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)消(xiao)(xiao)(xiao)化(hua)時間甚(shen)至可以長(chang)達15分鐘(zhong)。
3、 細(xi)胞的(de)(de)傳(chuan)代比(bi)例(li)(li)通(tong)常說的(de)(de)是等(deng)體積(ji)(ji)的(de)(de)容器(qi)，不同容器(qi)需(xu)要換算；例(li)(li)如：一個T25培(pei)(pei)(pei)養(yang)瓶(ping)的(de)(de)細(xi)胞傳(chuan)到一個10cm培(pei)(pei)(pei)養(yang)皿(min)里(li)面(mian)，雖然(ran)是1傳(chuan)1，但是比(bi)例(li)(li)可(ke)不是1:1；T25瓶(ping)底(di)面(mian)積(ji)(ji)25cm2，10cm培(pei)(pei)(pei)養(yang)皿(min)底(di)面(mian)積(ji)(ji)約(yue)為55cm2（10cm的(de)(de)培(pei)(pei)(pei)養(yang)皿(min)指的(de)(de)是培(pei)(pei)(pei)養(yang)皿(min)的(de)(de)外(wai)徑(jing)(jing)，而培(pei)(pei)(pei)養(yang)皿(min)的(de)(de)內徑(jing)(jing)約(yue)為8.4cm，故(gu)根據內徑(jing)(jing)可(ke)求(qiu)出其底(di)面(mian)積(ji)(ji)為55cm2），所以實際傳(chuan)代比(bi)例(li)(li)為1:2.2。
4、 在有(you)關離(li)(li)心(xin)(xin)機的(de)(de)實(shi)驗中(zhong)(zhong)，標準的(de)(de)離(li)(li)心(xin)(xin)條件應該是(shi)用(yong)RCF(relative centnifugal fieldt)來衡量，而在實(shi)際大家實(shi)驗過程中(zhong)(zhong)，往往習慣(guan)用(yong)rmp即每(mei)分鐘轉速(su)來表(biao)示(shi)；RCF即表(biao)示(shi)相對離(li)(li)心(xin)(xin)場，以重(zhong)力加速(su)度g(980.66cm/s2)的(de)(de)倍數來表(biao)示(shi)；RCF=1.119×10-5×(rpm)2×r（其中(zhong)(zhong)r表(biao)示(shi)離(li)(li)心(xin)(xin)機轉軸中(zhong)(zhong)心(xin)(xin)與離(li)(li)心(xin)(xin)管中(zhong)(zhong)心(xin)(xin)的(de)(de)距離(li)(li)，單位為(wei)cm）；所以每(mei)個(ge)實(shi)驗室離(li)(li)心(xin)(xin)機轉速(su)設(she)置是(shi)不一樣的(de)(de)，常規建(jian)議1200rpm 大約250g。