多肽合成
多肽合成又叫肽鏈合成，是一個固相合成順序一般從C端(羧基端)向N端(氨基端)合成。過去的多肽合成是在溶液中進行的稱為液相合成法。多肽的合成主要分為兩條途徑:化學合成多肽和生(sheng)物合成多(duo)肽。
多肽合成的原(yuan)理
多(duo)肽合成就(jiu)是如何把各種氨(an)基酸單位按照天然物的(de)氨(an)基酸排列順序和連(lian)接方式連(lian)接起來。由于氨(an)基酸在(zai)中(zhong)性(xing)條件下(xia)是以分子(zi)內的(de)兩性(xing)離子(zi)形(xing)式(H3+NCH(R)COO-)存在(zai)，因此，氨(an)基酸之間直(zhi)接縮合形(xing)成酰胺(an)鍵的(de)反應在(zai)一般條件下(xia)是難于進行的(de)。
氨基酸酯(zhi)的(de)反(fan)應(ying)活(huo)性(xing)(xing)較(jiao)高。在(zai)100℃下加熱或者(zhe)室溫下長時間放(fang)置(zhi)都能(neng)聚合(he)生成(cheng)肽酯(zhi)，但反(fan)應(ying)并沒有定向性(xing)(xing)，兩(liang)種氨基酸a1和a2的(de)酯(zhi)在(zai)聚合(he)時將(jiang)生成(cheng)a1a2…、a1a1…、a2a1…等(deng)各(ge)種任意順(shun)序(xu)的(de)混(hun)合(he)物。
為了得(de)到具有特(te)定(ding)順序(xu)的(de)合(he)成(cheng)多肽，采(cai)用任(ren)意聚合(he)的(de)方(fang)(fang)法是行(xing)不通(tong)的(de)，而只能(neng)采(cai)用逐步縮合(he)的(de)定(ding)向多肽合(he)成(cheng)方(fang)(fang)法。一般是如(ru)下式所(suo)示，即先(xian)將不需要反應的(de)氨(an)基或(huo)羧基用適當的(de)基團暫(zan)時保護起來(lai)，然(ran)后再進行(xing)連接反應，以保證多肽合(he)成(cheng)的(de)定(ding)向進行(xing)。
式中的(de)(de)X和Q分別為氨(an)基(ji)和羧基(ji)的(de)(de)保(bao)護基(ji)，它不僅可(ke)以防(fang)止亂接副反(fan)應的(de)(de)發生(sheng)，還具有(you)能消(xiao)除氨(an)基(ji)酸的(de)(de)兩性(xing)離子形式，并使之易溶(rong)于有(you)機溶(rong)劑的(de)(de)作用。
Q在有(you)(you)的(de)情(qing)況(kuang)下也可以不是共價連(lian)接的(de)基(ji)(ji)團(tuan)，而是由有(you)(you)機強堿(如三(san)乙胺(an))同(tong)氨基(ji)(ji)酸的(de)羧(suo)基(ji)(ji)氫離(li)子組成的(de)有(you)(you)機陽離(li)子。Y為一強的(de)吸(xi)電(dian)子基(ji)(ji)團(tuan)，它(ta)能(neng)使羧(suo)基(ji)(ji)活(huo)(huo)化，而有(you)(you)利于(yu)另(ling)一氨基(ji)(ji)酸的(de)自由氨基(ji)(ji)，對其(qi)活(huo)(huo)化羧(suo)基(ji)(ji)的(de)羧(suo)基(ji)(ji)碳原子進行親核(he)進攻生成酰(xian)胺(an)鍵(jian)。
由此所(suo)得的(de)(de)(de)(de)連(lian)接(jie)產物(wu)是(shi)N端和(he)C端都帶(dai)有保(bao)護基(ji)的(de)(de)(de)(de)保(bao)護肽(tai)，要脫去保(bao)護基(ji)后才能得到(dao)自(zi)由的(de)(de)(de)(de)肽(tai)。如(ru)果肽(tai)鏈不是(shi)到(dao)此為止，而是(shi)還(huan)需要從N端或(huo)C端延長肽(tai)鏈的(de)(de)(de)(de)話，則可(ke)以先(xian)選擇性地(di)脫去X或(huo)Q，然后再同(tong)新的(de)(de)(de)(de)N保(bao)護氨基(ji)酸(或(huo)肽(tai))或(huo)C保(bao)護的(de)(de)(de)(de)氨基(ji)酸(或(huo)肽(tai))進行**次連(lian)接(jie)，并依(yi)次不斷重復下去，直(zhi)到(dao)所(suo)需要的(de)(de)(de)(de)肽(tai)鏈長度為止。
對(dui)于長(chang)肽(tai)的(de)多肽(tai)合(he)成來(lai)說，一般有逐步增(zeng)長(chang)和(he)片段縮合(he)兩種伸長(chang)肽(tai)鏈的(de)方式，前者(zhe)是(shi)(shi)由(you)起始(shi)(shi)的(de)氨基酸(或肽(tai))開始(shi)(shi)。每連接一次，接長(chang)一個氨基酸，后者(zhe)則是(shi)(shi)用(yong)N保護(hu)肽(tai)同(tong)C保護(hu)肽(tai)縮合(he)來(lai)得(de)到兩者(zhe)長(chang)度相加的(de)新的(de)長(chang)肽(tai)鏈。
對于(yu)多肽(tai)合成中含有(you)谷氨酸(suan)(suan)、天冬(dong)氨酸(suan)(suan)、賴氨酸(suan)(suan)、精氨酸(suan)(suan)、組氨酸(suan)(suan)、半胱(guang)氨酸(suan)(suan)等(deng)等(deng)帶側(ce)鏈(lian)功(gong)能(neng)團(tuan)的(de)氨基(ji)酸(suan)(suan)的(de)肽(tai)來(lai)(lai)說，為(wei)了避免(mian)由(you)于(yu)側(ce)鏈(lian)功(gong)能(neng)團(tuan)所帶來(lai)(lai)的(de)副(fu)反應(ying)，一(yi)般也需要用適當的(de)保護(hu)基(ji)將(jiang)側(ce)鏈(lian)基(ji)團(tuan)暫時(shi)保護(hu)起來(lai)(lai)。
多肽合成方法分(fen)類
多(duo)肽的合(he)成主要分為兩(liang)條途徑:化(hua)學合(he)成多(duo)肽和生物合(he)成多(duo)肽。
化(hua)學(xue)合(he)(he)成(cheng)(cheng)(cheng)主要是以(yi)氨基酸(suan)與(yu)氨基酸(suan)之間縮合(he)(he)的(de)(de)(de)形式來(lai)進行。在合(he)(he)成(cheng)(cheng)(cheng)含(han)有(you)(you)特定(ding)順序的(de)(de)(de)多(duo)肽(tai)(tai)時(shi)，由于多(duo)肽(tai)(tai)合(he)(he)成(cheng)(cheng)(cheng)原料(liao)中(zhong)含(han)有(you)(you)官能度大于2的(de)(de)(de)氨基酸(suan)單體，多(duo)肽(tai)(tai)合(he)(he)成(cheng)(cheng)(cheng)時(shi)應將不需(xu)要反應的(de)(de)(de)基團暫(zan)時(shi)保(bao)護(hu)起來(lai)，方可(ke)進行成(cheng)(cheng)(cheng)肽(tai)(tai)反應，這樣保(bao)證了多(duo)肽(tai)(tai)合(he)(he)成(cheng)(cheng)(cheng)目(mu)標產物的(de)(de)(de)定(ding)向性。多(duo)肽(tai)(tai)的(de)(de)(de)化(hua)學(xue)合(he)(he)成(cheng)(cheng)(cheng)又(you)分為液相(xiang)合(he)(he)成(cheng)(cheng)(cheng)和(he)固相(xiang)合(he)(he)成(cheng)(cheng)(cheng)。
多(duo)(duo)(duo)肽(tai)(tai)(tai)液相合(he)(he)成(cheng)(cheng)(cheng)主要分為(wei)(wei)逐步合(he)(he)成(cheng)(cheng)(cheng)和(he)片(pian)段(duan)(duan)組合(he)(he)兩種策略。逐步合(he)(he)成(cheng)(cheng)(cheng)簡潔(jie)迅速，可(ke)用于各種生(sheng)物活性多(duo)(duo)(duo)肽(tai)(tai)(tai)片(pian)段(duan)(duan)的合(he)(he)成(cheng)(cheng)(cheng)。片(pian)段(duan)(duan)組合(he)(he)法(fa)主要包括天然化(hua)學連接(jie)和(he)施(shi)陶(tao)丁格連接(jie)。近年，多(duo)(duo)(duo)肽(tai)(tai)(tai)液相片(pian)段(duan)(duan)合(he)(he)成(cheng)(cheng)(cheng)法(fa)發展(zhan)迅速，在多(duo)(duo)(duo)肽(tai)(tai)(tai)和(he)蛋(dan)白質合(he)(he)成(cheng)(cheng)(cheng)領域已取得了重(zhong)大突破(po)。在多(duo)(duo)(duo)肽(tai)(tai)(tai)片(pian)段(duan)(duan)合(he)(he)成(cheng)(cheng)(cheng)法(fa)中，根據多(duo)(duo)(duo)肽(tai)(tai)(tai)片(pian)段(duan)(duan)的化(hua)學特定性或化(hua)學選擇性，多(duo)(duo)(duo)肽(tai)(tai)(tai)片(pian)段(duan)(duan)能夠自發進行(xing)連接(jie)，得到目(mu)標多(duo)(duo)(duo)肽(tai)(tai)(tai)。因為(wei)(wei)多(duo)(duo)(duo)肽(tai)(tai)(tai)片(pian)段(duan)(duan)含有的氨基酸殘基相對(dui)較少(shao)，所(suo)以純(chun)(chun)度較高，且易于純(chun)(chun)化(hua)。
多肽(tai)的(de)生(sheng)物合成(cheng)方法主要包括(kuo)發酵法、酶解(jie)法，隨著生(sheng)物工程技(ji)術的(de)發展，以DNA重組技(ji)術為主導的(de)基(ji)因工程法也被應用于(yu)多肽(tai)的(de)合成(cheng)。
多(duo)肽(tai)的固相合成
多(duo)肽(tai)的(de)(de)合(he)(he)成是氨(an)(an)基(ji)(ji)酸(suan)重復添加的(de)(de)過(guo)(guo)程(cheng)，通常從C端(duan)向N端(duan)(氨(an)(an)基(ji)(ji)端(duan))進行合(he)(he)成。多(duo)肽(tai)固相合(he)(he)成的(de)(de)原(yuan)理是將(jiang)目的(de)(de)肽(tai)的(de)(de)**個氨(an)(an)基(ji)(ji)酸(suan)C端(duan)通過(guo)(guo)共價鍵與固相載體連接(jie)，再以(yi)該氨(an)(an)基(ji)(ji)酸(suan)N端(duan)為(wei)合(he)(he)成起點，經(jing)過(guo)(guo)脫去氨(an)(an)基(ji)(ji)保護基(ji)(ji)和過(guo)(guo)量的(de)(de)已活化的(de)(de)**個氨(an)(an)基(ji)(ji)酸(suan)進行反(fan)應，接(jie)長肽(tai)鏈(lian)(lian)，重復操(cao)作(zuo)，達(da)到理想的(de)(de)合(he)(he)成肽(tai)鏈(lian)(lian)長度，*后將(jiang)肽(tai)鏈(lian)(lian)從樹(shu)脂(zhi)上裂解(jie)下來，分離純化，獲(huo)得目標多(duo)肽(tai)。
1、Boc多肽合成法(fa)
Boc方(fang)法是(shi)經典的多(duo)肽(tai)固相合成(cheng)法，以(yi)Boc作為氨(an)基(ji)(ji)酸α-氨(an)基(ji)(ji)的保(bao)(bao)(bao)護(hu)基(ji)(ji)，芐醇(chun)類作為側(ce)鏈保(bao)(bao)(bao)護(hu)基(ji)(ji)，Boc的脫除(chu)通(tong)常采用(yong)三氟(fu)乙酸(TFA)進行。多(duo)肽(tai)合成(cheng)時將(jiang)已(yi)用(yong)Boc保(bao)(bao)(bao)護(hu)好的N-α-氨(an)基(ji)(ji)酸共價交聯到樹脂上，TFA切(qie)除(chu)Boc保(bao)(bao)(bao)護(hu)基(ji)(ji)，N端用(yong)弱堿中和。
肽鏈的(de)延(yan)長通過二環(huan)己基碳二亞(ya)胺(DCC)活化(hua)、偶聯進行，*終采(cai)用強(qiang)酸(suan)(suan)氫氟酸(suan)(suan)(HF)法(fa)或三氟甲磺酸(suan)(suan)(TFMSA)將合成的(de)目標(biao)多(duo)(duo)肽從(cong)樹脂上(shang)解離。在Boc多(duo)(duo)肽合成法(fa)中，為了便于下一步的(de)多(duo)(duo)肽合成，反復用酸(suan)(suan)進行脫保(bao)護，一些副反應被帶入實驗中，例如多(duo)(duo)肽容(rong)易從(cong)樹脂上(shang)切除(chu)下來，氨基酸(suan)(suan)側鏈在酸(suan)(suan)性條件不(bu)穩(wen)定等。
2、Fmoc多肽合成法
Carpino和Han以Boc多(duo)肽合(he)成(cheng)法為基礎發展起來一種多(duo)肽固相合(he)成(cheng)的(de)新方(fang)法——Fmoc多(duo)肽合(he)成(cheng)法。
Fmoc多肽合(he)成法以Fmoc作為氨基酸α-氨基的(de)(de)保護(hu)基。其優勢(shi)為在酸性條件下(xia)是(shi)穩定的(de)(de)，不受TFA等試劑的(de)(de)影(ying)響，應用溫和的(de)(de)堿處理可脫保護(hu)，所以側鏈可用易于酸脫除的(de)(de)Boc保護(hu)基進行保護(hu)。
肽段(duan)的(de)*后切除(chu)可采(cai)用TFA/二氯甲烷(DCM)從樹(shu)脂(zhi)上定量(liang)完成，避(bi)免了采(cai)用強酸。同(tong)時，與Boc法(fa)相比，Fmoc法(fa)反(fan)應(ying)條(tiao)件溫和，副反(fan)應(ying)少，產率高，并(bing)且(qie)Fmoc基團(tuan)本身具有(you)特征性(xing)紫外吸收，易于(yu)監測控制反(fan)應(ying)的(de)進行。Fmoc法(fa)在多(duo)肽固相合成領域應(ying)用越(yue)來越(yue)廣泛。
多肽液(ye)相分段合成
隨著多(duo)肽(tai)合成(cheng)(cheng)的(de)發展，多(duo)肽(tai)液相分段合成(cheng)(cheng)(即多(duo)肽(tai)片段在溶液中依據其化(hua)學(xue)專(zhuan)一(yi)性或化(hua)學(xue)選擇性，自發連接成(cheng)(cheng)長肽(tai)的(de)合成(cheng)(cheng)方法(fa))在多(duo)肽(tai)合成(cheng)(cheng)領域中的(de)作用越來越突出。其特點在于可以(yi)用于長肽(tai)的(de)合成(cheng)(cheng)，并且純度高(gao)，易于純化(hua)。
多(duo)肽(tai)(tai)液相分(fen)(fen)段(duan)合(he)成主(zhu)要分(fen)(fen)為天然化學(xue)連接(jie)(jie)和(he)施陶丁(ding)格連接(jie)(jie)。天然化學(xue)連接(jie)(jie)是多(duo)肽(tai)(tai)分(fen)(fen)段(duan)合(he)成的(de)基(ji)礎(chu)方法，局限(xian)在于(yu)所合(he)成的(de)多(duo)肽(tai)(tai)必須含(han)半(ban)光氨(an)酸(Cys)殘(can)基(ji)，因而限(xian)定了(le)天然化學(xue)連接(jie)(jie)方法的(de)應用(yong)范(fan)圍。天然化學(xue)連接(jie)(jie)方法的(de)延伸包括(kuo)化學(xue)區(qu)域選擇連接(jie)(jie)、可除去輔助基(ji)連接(jie)(jie)、光敏感輔助基(ji)連接(jie)(jie)。
施陶丁格連接(jie)方法(fa)是(shi)另(ling)一(yi)種(zhong)基礎的(de)片段連接(jie)方法(fa)，其(qi)為多(duo)肽片段連接(jie)途徑開拓了更(geng)廣闊(kuo)的(de)思(si)路。正交化學(xue)連接(jie)方法(fa)是(shi)施陶丁格連接(jie)方法(fa)的(de)延(yan)伸(shen)，通(tong)過簡(jian)化膦(lin)硫酯(zhi)輔助基來(lai)提高片段間的(de)縮合率(lv)。
其他多肽合成(cheng)方法
1、氨基酸的(de)羧內酸酐法(fa)(NCA)
氨(an)基(ji)酸(suan)的羧(suo)內酸(suan)酐的氨(an)基(ji)保護基(ji)也可活(huo)化羧(suo)基(ji)。
NCA的(de)(de)原理:在堿性條件下(xia)，氨(an)基酸陰離(li)子(zi)與NCA形(xing)成(cheng)(cheng)一個更穩定的(de)(de)氨(an)基甲酸酯類離(li)子(zi)，在酸化時該離(li)子(zi)失去(qu)二氧化碳，生(sheng)成(cheng)(cheng)二肽。生(sheng)成(cheng)(cheng)的(de)(de)二肽又(you)與其(qi)他(ta)的(de)(de)NCA結合，反(fan)復進行。
NCA適用(yong)于短(duan)鏈肽(tai)片(pian)段(duan)的多肽(tai)合成，其周(zhou)期短(duan)、操作簡單、成本(ben)低、得(de)到(dao)產(chan)物分子(zi)量(liang)高，在目前多肽(tai)合成中所占(zhan)比例較(jiao)大，技術也較(jiao)為通用(yong)。
2、組合化學(xue)法
20世紀80年(nian)代，以(yi)固相(xiang)多(duo)(duo)肽(tai)合(he)(he)成為(wei)基礎(chu)提出(chu)了組(zu)(zu)合(he)(he)化學(xue)法，即(ji)氨基酸的構建單元通過組(zu)(zu)合(he)(he)的方(fang)(fang)式(shi)進行連接，合(he)(he)成出(chu)含(han)有大量(liang)化合(he)(he)物(wu)的化學(xue)庫，并從中篩選出(chu)具有某(mou)種理化性質或藥理活性化合(he)(he)物(wu)的一套多(duo)(duo)肽(tai)合(he)(he)成策(ce)略(lve)和篩選方(fang)(fang)案。
組(zu)合(he)(he)(he)化(hua)學法的(de)多(duo)肽(tai)合(he)(he)(he)成(cheng)策略主要(yao)包(bao)括:混(hun)合(he)(he)(he)-均分法、迭(die)代法、光控(kong)定位組(zu)合(he)(he)(he)庫(ku)法、茶(cha)葉袋法等。組(zu)合(he)(he)(he)化(hua)學法的(de)*大優點(dian)在于(yu)可同時合(he)(he)(he)成(cheng)多(duo)種化(hua)合(he)(he)(he)物(wu)，并且(qie)能*大限度地篩(shai)選(xuan)各種新化(hua)合(he)(he)(he)物(wu)及其異構體。
3、酶解法(fa)
酶(mei)解(jie)法是用生物酶(mei)降解(jie)植物蛋(dan)(dan)白(bai)質和動物蛋(dan)(dan)白(bai)質，獲(huo)得小分子(zi)多(duo)肽(tai)。酶(mei)解(jie)法因其(qi)多(duo)肽(tai)產量低、投(tou)資大(da)、周期(qi)長、污(wu)染嚴重，未能(neng)實(shi)現工業(ye)化生產。酶(mei)解(jie)法獲(huo)得的(de)多(duo)肽(tai)能(neng)夠保留蛋(dan)(dan)白(bai)質原(yuan)有的(de)營養價(jia)值，并且可以獲(huo)得比(bi)原(yuan)蛋(dan)(dan)白(bai)質更多(duo)的(de)功能(neng)，更加(jia)綠色，更加(jia)健康(kang)。
4、基因工程法
基因工程(cheng)法主要以(yi)DNA重組(zu)技術為(wei)基礎，通(tong)過合適的DNA模(mo)板來控制多肽的序(xu)列合成。有研究(jiu)者通(tong)過基因工程(cheng)法獲得了準彈性蛋白-聚(ju)纈(xie)氨酸-脯氨酸-甘氨酸-纈(xie)氨酸-甘氨酸肽(VPGVG)。
利(li)用基因(yin)(yin)工程技(ji)術生(sheng)產的(de)活性多肽(tai)還有肽(tai)類抗(kang)生(sheng)素(su)(su)、干擾素(su)(su)類、白(bai)介素(su)(su)類、生(sheng)長因(yin)(yin)子類、腫瘤壞死因(yin)(yin)子、人生(sheng)長激素(su)(su)，血液中凝血因(yin)(yin)子、促(cu)紅細胞生(sheng)成素(su)(su)，組(zu)織(zhi)非蛋白(bai)纖溶酶原等(deng)。
基因(yin)工程法(fa)合(he)成多(duo)肽具有(you)表(biao)達(da)定向性(xing)強(qiang)，**衛生，原料(liao)來源廣泛和成本(ben)低(di)等優(you)點，但因(yin)存(cun)在高效表(biao)達(da)，不易分離，產率低(di)的問題(ti)，難以實現(xian)規模(mo)化生產。
5、發酵法
發酵(jiao)法是從(cong)微生(sheng)物(wu)(wu)代謝產物(wu)(wu)中獲得多肽(tai)的方法。雖然發酵(jiao)法的成本低，但其應用(yong)范圍較窄，因(yin)為現在微生(sheng)物(wu)(wu)能夠獨立合成的聚氨(an)基酸(suan)只有ε-聚賴氨(an)酸(suan)(ε-PL)、γ-聚谷氨(an)酸(suan)(γ-PGA)和藍細菌肽(tai)。
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